Prinsip dan Metode Analisis Kuantitatif dengan Kromatografi Cair

Mekanisme pemisahan kromatografi cair didasarkan pada perbedaan afinitas komponen-komponen dalam campuran untuk kedua fasa.

Berdasarkan perbedaan fasa diamnya, kromatografi cair dibedakan menjadi kromatografi cair-padat, kromatografi cair-cair, dan kromatografi fasa terikat.Yang paling banyak digunakan adalah kromatografi cair-padat dengan silika gel sebagai pengisi dan kromatografi fase terikat dengan mikrosilika sebagai matriks.

Berdasarkan bentuk fasa diamnya, kromatografi cair dibedakan menjadi kromatografi kolom, kromatografi kertas, dan kromatografi lapis tipis.Menurut kapasitas adsorpsinya, dapat dibedakan menjadi kromatografi adsorpsi, kromatografi partisi, kromatografi penukar ion, dan kromatografi permeasi gel.

Dalam beberapa tahun terakhir, sistem aliran cairan bertekanan tinggi telah ditambahkan ke sistem kromatografi kolom cair untuk membuat fase gerak mengalir cepat di bawah tekanan tinggi untuk meningkatkan efek pemisahan, sehingga kromatografi cair efisiensi tinggi (juga dikenal sebagai tekanan tinggi) telah muncul.

BAGIAN
01 Prinsip Analisis Kuantitatif Kromatografi Cair

Untuk mengukur berdasarkan kualitatif, diperlukan zat murni sebagai standar;

Kuantifikasi kromatografi cair adalah metode yang relatif kuantitatif: yaitu, jumlah analit dalam campuran diperkirakan dari jumlah sampel standar murni yang diketahui.

BAGIAN
02 Dasar Kuantifikasi dengan Kromatografi Cair

Besarnya komponen terukur (W) sebanding dengan nilai respon (A) (tinggi puncak atau luas puncak), W=f×A.

Faktor koreksi kuantitatif (f): Merupakan konstanta proporsionalitas dari rumus perhitungan kuantitatif, dan arti fisisnya adalah jumlah komponen terukur yang diwakili oleh nilai respon satuan (luas puncak).

Faktor koreksi kuantitatif dapat diperoleh dari jumlah sampel standar yang diketahui dan nilai responsnya.

Ukur nilai respon dari komponen yang tidak diketahui, dan besarnya komponen dapat diperoleh dengan faktor koreksi kuantitatif.

BAGIAN
03 Istilah-istilah umum dalam analisis kuantitatif

Sampel (sampel): larutan yang mengandung analit untuk analisis kromatografi.Dibagi menjadi sampel standar dan sampel tidak diketahui.

Standar: Produk murni dengan konsentrasi yang diketahui.Sampel tidak diketahui (unknown): Campuran yang konsentrasinya akan diuji.

Berat sampel : Berat asli sampel yang akan diuji.

Pengenceran: Faktor pengenceran sampel yang tidak diketahui.

Komponen : puncak kromatografi yang akan dianalisis secara kuantitatif, yaitu analit yang tidak diketahui kandungannya.

Jumlah komponen (jumlah): kandungan (atau konsentrasi) zat yang akan diuji.

Integritas : Proses komputasi pengukuran luas puncak puncak kromatografi oleh komputer.

Kurva kalibrasi: Kurva linier antara kandungan komponen versus nilai respons, yang ditetapkan dari sejumlah zat standar yang diketahui, digunakan untuk menentukan kandungan analit yang tidak diketahui.

BAGIAN
04 Analisis Kuantitatif Kromatografi Cair

1. Pilih metode kromatografi yang cocok untuk analisis kuantitatif:

l Konfirmasikan puncak komponen yang terdeteksi dan capai resolusi (R) lebih besar dari 1,5

l Tentukan konsistensi (kemurnian) puncak kromatografi komponen yang diuji

l Menentukan batas deteksi dan batas kuantifikasi metode;sensitivitas dan rentang linier

2. Tetapkan kurva kalibrasi dengan sampel standar dengan konsentrasi berbeda

3. Memeriksa keakuratan dan ketepatan metode kuantitatif

4. Gunakan perangkat lunak manajemen kromatografi yang sesuai untuk melaksanakan pengumpulan sampel, pemrosesan data, dan melaporkan hasil

BAGIAN
05 Identifikasi puncak kuantitatif (kualitatif)

Identifikasi secara kualitatif setiap puncak kromatografi yang akan diukur

Pertama, gunakan sampel standar untuk menentukan waktu retensi (Rt) dari puncak kromatografi yang akan diukur.Dengan membandingkan waktu retensi, temukan komponen yang sesuai dengan setiap puncak kromatografi dalam sampel yang tidak diketahui.Metode kromatografi kualitatif adalah membandingkan waktu retensi dengan sampel standar.Kriteria Tidak Memadaikonfirmasi lebih lanjut (kualitatif)

1. Metode penjumlahan standar

2. Gunakan metode lain secara bersamaan: metode kromatografi lain (ubah mekanismenya, seperti: menggunakan kolom kromatografi berbeda), detektor lain (PDA: perbandingan spektrum, pencarian perpustakaan spektrum; MS: analisis spektrum massa, pencarian perpustakaan spektrum)

3. Instrumen dan metode lainnya

BAGIAN
06 Konfirmasi Konsistensi Puncak Kuantitatif

Konfirmasikan konsistensi puncak kromatografi (kemurnian)

Pastikan hanya ada satu komponen terukur di bawah setiap puncak kromatografi

Periksa gangguan dari zat yang ikut mengeluting (kotoran)

Metode Konfirmasi Konsistensi Puncak Kromatografi (Kemurnian)

Membandingkan Spektogram dengan Detektor Photodiode Matrix (PDA).

Identifikasi Kemurnian Puncak

2996 Teori Sudut Kemurnian

Metode kuantitatif yang biasa digunakan pada BAGIAN 07

Metode kurva standar, dibagi menjadi metode standar eksternal dan metode standar internal:

1. Metode standar eksternal: paling banyak digunakan dalam kromatografi cair

Serangkaian sampel standar dengan konsentrasi yang diketahui disiapkan menggunakan sampel murni dari senyawa yang akan diuji sebagai sampel standar.disuntikkan ke dalam kolom hingga nilai responsnya (luas puncak).
Dalam rentang tertentu terdapat hubungan linier yang baik antara konsentrasi sampel standar dengan nilai respon yaitu W= f×A , dan dibuatlah kurva standar.

Di bawah kondisi eksperimen yang sama persis, masukkan sampel yang tidak diketahui untuk mendapatkan nilai respons komponen yang akan diukur.Berdasarkan koefisien f yang diketahui, konsentrasi komponen yang akan diukur dapat diperoleh.

Keuntungan metode standar eksternal:operasi dan perhitungan sederhana, ini adalah metode kuantitatif yang umum digunakan;tidak perlu setiap komponen dideteksi dan dielusi;sampel standar diperlukan;kondisi pengukuran sampel standar dan sampel yang tidak diketahui harus konsisten;volume injeksi harus tepat.

Kerugian dari metode standar eksternal:Kondisi percobaan harus tinggi, seperti sensitivitas detektor, laju aliran, dan komposisi fase gerak tidak dapat diubah;volume setiap injeksi harus memiliki kemampuan pengulangan yang baik.

2. Metode standar internal: akurat, tapi merepotkan, paling banyak digunakan dalam metode standar

Sejumlah standar internal yang diketahui ditambahkan ke standar untuk membuat standar campuran, dan serangkaian standar kerja dengan konsentrasi yang diketahui disiapkan.Rasio molar standar terhadap standar internal dalam standar campuran tetap tidak berubah.Suntikkan ke dalam kolom kromatografi dan ambil (luas puncak sampel standar/luas puncak sampel standar internal) sebagai nilai respons.Berdasarkan hubungan linier antara nilai respon dengan konsentrasi standar kerja yaitu W= f×A , dibuat kurva standar.

Sejumlah standar internal yang diketahui ditambahkan ke sampel yang tidak diketahui dan disuntikkan ke dalam kolom untuk memperoleh nilai respons komponen yang akan diukur.Berdasarkan koefisien f yang diketahui, konsentrasi komponen yang akan diukur dapat diperoleh.

Ciri-ciri metode standar internal:Selama pengoperasian, sampel dan standar internal dicampur bersama dan disuntikkan ke dalam kolom kromatografi, sehingga selama perbandingan jumlah komponen yang diukur dengan standar internal dalam larutan campuran adalah konstan, perubahan volume sampel tidak akan mempengaruhi hasil kuantitatif..Metode standar internal mengimbangi pengaruh volume sampel, dan bahkan fase gerak dan detektor, sehingga lebih akurat dibandingkan metode standar eksternal.

BAGIAN
08 Faktor-Faktor yang Mempengaruhi Hasil Analisis Kuantitatif

Akurasi yang buruk dapat disebabkan oleh:

Integrasi area puncak yang salah, dekomposisi sampel atau kotoran yang masuk selama persiapan sampel, botol sampel tidak tersegel, penguapan sampel atau pelarut, persiapan sampel yang salah, masalah injeksi sampel, persiapan standar internal yang salah

Kemungkinan alasan presisi yang buruk:

Integrasi puncak yang salah, masalah injeksi atau injektor, dekomposisi sampel atau kotoran yang masuk selama preparasi sampel, masalah kromatografi, respons detektor terdegradasi