Kromatografi cair merupakan metode utama untuk menguji kandungan setiap komponen dan pengotor pada bahan mentah, zat antara, sediaan dan bahan pengemas, namun banyak zat yang tidak memiliki metode standar yang dapat diandalkan, sehingga pengembangan metode baru tidak dapat dihindari. Dalam pengembangan metode fase cair, kolom kromatografi merupakan inti dari kromatografi cair, sehingga pemilihan kolom kromatografi yang sesuai sangatlah penting. Pada artikel ini, penulis akan menjelaskan cara memilih kolom kromatografi cair dari tiga aspek: gagasan keseluruhan, pertimbangan, dan ruang lingkup penerapan.
A.Ide keseluruhan untuk memilih kolom kromatografi cair
1. Mengevaluasi sifat fisik dan kimia analit: seperti struktur kimia, kelarutan, stabilitas (misalnya mudah teroksidasi/reduksi/hidrolisis), keasaman dan alkalinitas, dll, terutama struktur kimia adalah kuncinya faktor penentu sifat, seperti gugus terkonjugasi memiliki serapan ultraviolet yang kuat dan fluoresensi yang kuat;
2. Tentukan tujuan analisis: apakah diperlukan pemisahan tinggi, efisiensi kolom tinggi, waktu analisis singkat, sensitivitas tinggi, ketahanan tekanan tinggi, umur kolom panjang, biaya rendah, dll;
- Pilih kolom kromatografi yang sesuai: pahami komposisi, sifat fisik dan kimia pengisi kromatografi, seperti ukuran partikel, ukuran pori, toleransi suhu, toleransi pH, adsorpsi analit, dll.
- Pertimbangan pemilihan kolom kromatografi cair
Bab ini akan membahas faktor-faktor yang perlu dipertimbangkan ketika memilih kolom kromatografi dari sudut pandang sifat fisik dan kimia kolom kromatografi itu sendiri. 2.1 Matriks pengisi
2.1.1 Matriks silika gel Matriks pengisi sebagian besar kolom kromatografi cair adalah silika gel. Jenis pengisi ini memiliki kemurnian tinggi, biaya rendah, kekuatan mekanik tinggi, dan gugus yang mudah dimodifikasi (seperti ikatan fenil, ikatan amino, ikatan siano, dll.), tetapi nilai pH dan kisaran suhu yang dapat ditoleransi terbatas: the Kisaran pH sebagian besar pengisi matriks silika gel adalah 2 hingga 8, namun kisaran pH fase ikatan gel silika yang dimodifikasi secara khusus dapat mencapai 1,5 hingga 10, dan ada juga fase ikatan gel silika yang dimodifikasi secara khusus yang stabil pada pH rendah, seperti stablebond Agilent ZORBAX RRHD-C18, yang stabil pada pH 1 hingga 8; batas suhu atas matriks silika gel biasanya 60 ℃, dan beberapa kolom kromatografi dapat mentolerir suhu 40 ℃ pada pH tinggi.
2.1.2 Matriks polimer Pengisi polimer sebagian besar berupa polistiren-divinilbenzena atau polimetakrilat. Keuntungannya adalah dapat menoleransi kisaran pH yang luas – dapat digunakan pada kisaran 1 hingga 14, dan lebih tahan terhadap suhu tinggi (dapat mencapai di atas 80 °C). Dibandingkan dengan pengisi C18 berbahan dasar silika, pengisi jenis ini memiliki hidrofobisitas yang lebih kuat, dan polimer makropori sangat efektif dalam memisahkan sampel seperti protein. Kerugiannya adalah efisiensi kolom lebih rendah dan kekuatan mekaniknya lebih lemah dibandingkan pengisi berbahan dasar silika. 2.2 Bentuk partikel
Kebanyakan pengisi HPLC modern berbentuk partikel bulat, namun terkadang berbentuk partikel tidak beraturan. Partikel berbentuk bola dapat memberikan tekanan kolom yang lebih rendah, efisiensi kolom yang lebih tinggi, stabilitas, dan umur yang lebih lama; ketika menggunakan fase gerak dengan viskositas tinggi (seperti asam fosfat) atau ketika larutan sampel kental, partikel tidak beraturan memiliki luas permukaan spesifik yang lebih besar, yang lebih kondusif bagi aksi penuh kedua fase, dan harganya relatif rendah. 2.3 Ukuran partikel
Semakin kecil ukuran partikel, semakin tinggi efisiensi kolom dan semakin tinggi pemisahannya, namun semakin buruk ketahanan terhadap tekanan tinggi. Kolom yang paling umum digunakan adalah kolom ukuran partikel 5 μm; jika persyaratan pemisahannya tinggi, pengisi 1,5-3 μm dapat dipilih, yang kondusif untuk memecahkan masalah pemisahan beberapa matriks kompleks dan sampel multi-komponen. UPLC dapat menggunakan pengisi 1,5 μm; Pengisi ukuran partikel 10 μm atau lebih besar sering digunakan untuk kolom semi preparatif atau preparatif. 2.4 Kandungan karbon
Kandungan karbon mengacu pada proporsi fase terikat pada permukaan gel silika, yang terkait dengan luas permukaan spesifik dan cakupan fase terikat. Kandungan karbon yang tinggi memberikan kapasitas kolom yang tinggi dan resolusi yang tinggi, dan sering digunakan untuk sampel kompleks yang memerlukan pemisahan yang tinggi, namun karena waktu interaksi yang lama antara kedua fase, waktu analisis menjadi lama; Kolom kromatografi kandungan karbon rendah memiliki waktu analisis yang lebih singkat dan dapat menunjukkan selektivitas yang berbeda, dan sering digunakan untuk sampel sederhana yang memerlukan analisis cepat dan sampel yang memerlukan kondisi fase air tinggi. Umumnya kandungan karbon C18 berkisar antara 7% hingga 19%. 2.5 Ukuran pori dan luas permukaan spesifik
Media adsorpsi HPLC adalah partikel berpori, dan sebagian besar interaksi terjadi di pori-pori. Oleh karena itu, molekul harus masuk ke pori-pori untuk diadsorpsi dan dipisahkan.
Ukuran pori dan luas permukaan spesifik adalah dua konsep yang saling melengkapi. Ukuran pori yang kecil berarti luas permukaan spesifik yang besar, dan sebaliknya. Luas permukaan spesifik yang besar dapat meningkatkan interaksi antara molekul sampel dan fase terikat, meningkatkan retensi, meningkatkan pemuatan sampel dan kapasitas kolom, serta pemisahan komponen kompleks. Pengisi berpori penuh termasuk dalam jenis pengisi ini. Bagi mereka yang memiliki persyaratan pemisahan yang tinggi, disarankan untuk memilih pengisi dengan luas permukaan spesifik yang besar; luas permukaan spesifik yang kecil dapat mengurangi tekanan balik, meningkatkan efisiensi kolom, dan mengurangi waktu kesetimbangan, yang cocok untuk analisis gradien. Pengisi inti-cangkang termasuk dalam jenis pengisi ini. Dengan alasan untuk memastikan pemisahan, disarankan untuk memilih pengisi dengan luas permukaan spesifik yang kecil untuk pengisi dengan persyaratan efisiensi analisis yang tinggi. 2.6 Volume pori dan kekuatan mekanik
Volume pori, juga dikenal sebagai “volume pori”, mengacu pada ukuran volume rongga per satuan partikel. Ini juga dapat mencerminkan kekuatan mekanik pengisi. Kekuatan mekanik bahan pengisi dengan volume pori besar sedikit lebih lemah dibandingkan bahan pengisi dengan volume pori kecil. Pengisi dengan volume pori kurang dari atau sama dengan 1,5 mL/g sebagian besar digunakan untuk pemisahan HPLC, sedangkan pengisi dengan volume pori lebih besar dari 1,5 mL/g terutama digunakan untuk kromatografi eksklusi molekuler dan kromatografi tekanan rendah. 2.7 Tingkat pembatasan
Penutupan dapat mengurangi puncak tailing yang disebabkan oleh interaksi antara senyawa dan gugus silanol yang terpapar (seperti ikatan ionik antara senyawa basa dan gugus silanol, gaya van der Waals, dan ikatan hidrogen antara senyawa asam dan gugus silanol), sehingga meningkatkan efisiensi kolom dan bentuk puncak. . Fase terikat yang tidak tertutup akan menghasilkan selektivitas yang berbeda dibandingkan dengan fase terikat yang tertutup, terutama untuk sampel polar.
- Ruang lingkup penerapan kolom kromatografi cair yang berbeda
Bab ini akan menjelaskan ruang lingkup penerapan berbagai jenis kolom kromatografi cair melalui beberapa kasus.
3.1 Kolom kromatografi C18 fase terbalik
Kolom C18 adalah kolom fase terbalik yang paling umum digunakan, yang dapat memenuhi uji kandungan dan pengotor sebagian besar zat organik, dan dapat diterapkan pada zat polar sedang, polar lemah, dan non-polar. Jenis dan spesifikasi kolom kromatografi C18 harus dipilih sesuai dengan persyaratan pemisahan spesifik. Misalnya, untuk zat dengan persyaratan pemisahan tinggi, spesifikasi 5 μm*4,6 mm*250 mm sering digunakan; untuk zat dengan matriks pemisahan kompleks dan polaritas serupa, spesifikasi 4 μm*4,6 mm*250 mm atau ukuran partikel lebih kecil dapat digunakan. Misalnya, penulis menggunakan kolom 3 μm*4,6 mm*250 mm untuk mendeteksi dua pengotor genotoksik di celecoxib API. Pemisahan kedua zat tersebut bisa mencapai 2,9 yang sangat baik. Selain itu, dengan alasan memastikan pemisahan, jika analisis cepat diperlukan, kolom pendek 10 mm atau 15 mm sering dipilih. Misalnya, ketika penulis menggunakan LC-MS/MS untuk mendeteksi pengotor genotoksik dalam API piperaquine fosfat, digunakan kolom 3 μm*2,1 mm*100 mm. Pemisahan antara pengotor dan komponen utama adalah 2,0, dan deteksi sampel dapat diselesaikan dalam 5 menit. 3.2 Kolom fenil fase terbalik
Kolom fenil juga merupakan jenis kolom fase terbalik. Kolom jenis ini mempunyai selektivitas yang kuat terhadap senyawa aromatik. Jika respon senyawa aromatik yang diukur dengan kolom C18 biasa lemah, Anda dapat mempertimbangkan untuk mengganti kolom fenil. Misalnya, ketika saya membuat celecoxib API, respons komponen utama yang diukur dengan kolom fenil dari pabrikan yang sama dan spesifikasi yang sama (semuanya 5 μm*4,6 mm*250 mm) adalah sekitar 7 kali lipat dari kolom C18. 3.3 Kolom fase normal
Sebagai pelengkap yang efektif untuk kolom fase terbalik, kolom fase normal cocok untuk senyawa yang sangat polar. Jika puncaknya masih sangat cepat ketika dielusi dengan lebih dari 90% fasa air dalam kolom fasa terbalik, dan bahkan mendekati dan tumpang tindih dengan puncak pelarut, Anda dapat mempertimbangkan untuk mengganti kolom fasa normal. Jenis kolom ini meliputi kolom hilik, kolom amino, kolom siano, dll.
3.3.1 Kolom hilik Kolom hilik biasanya melekatkan gugus hidrofilik pada rantai alkil yang terikat untuk meningkatkan respons terhadap zat polar. Kolom jenis ini cocok untuk analisis zat gula. Penulis menggunakan kolom jenis ini ketika melakukan pengukuran kandungan dan zat terkait xilosa dan turunannya. Isomer turunan xilosa juga dapat dipisahkan dengan baik;
3.3.2 Kolom amino dan kolom siano Kolom amino dan kolom siano mengacu pada pengenalan modifikasi amino dan siano pada akhir rantai alkil terikat, masing-masing, untuk meningkatkan selektivitas zat khusus: misalnya, kolom amino adalah pilihan yang baik untuk pemisahan gula, asam amino, basa, dan Amida; kolom siano memiliki selektivitas yang lebih baik dalam memisahkan zat serupa struktural terhidrogenasi dan tidak terhidrogenasi karena adanya ikatan terkonjugasi. Kolom amino dan kolom siano sering kali dapat dialihkan antara kolom fase normal dan kolom fase terbalik, tetapi peralihan yang sering tidak disarankan. 3.4 Kolom kiral
Kolom kiral sesuai dengan namanya cocok untuk pemisahan dan analisis senyawa kiral khususnya di bidang farmasi. Jenis kolom ini dapat dipertimbangkan ketika kolom fase balik konvensional dan fase normal tidak dapat mencapai pemisahan isomer. Misalnya, penulis menggunakan kolom kiral 5 μm*4,6 mm*250 mm untuk memisahkan dua isomer 1,2-diphenylethylenediamine: (1S, 2S)-1, 2-diphenylethylenediamine dan (1R, 2R)-1, 2 -diphenylethylenediamine, dan pemisahan antara keduanya mencapai sekitar 2,0. Namun, kolom kiral lebih mahal dibandingkan jenis kolom lainnya, biasanya 1W+/potong. Jika kolom seperti itu diperlukan, unit perlu menyediakan anggaran yang cukup. 3.5 Kolom pertukaran ion
Kolom penukar ion cocok untuk pemisahan dan analisis ion bermuatan, seperti ion, protein, asam nukleat, dan beberapa zat gula. Menurut jenis pengisinya, dibagi menjadi kolom penukar kation, kolom penukar anion, dan kolom penukar kation kuat.
Kolom penukar kation mencakup kolom berbasis kalsium dan kolom berbasis hidrogen, yang terutama cocok untuk analisis zat kationik seperti asam amino. Misalnya, penulis menggunakan kolom berbasis kalsium ketika menganalisis kalsium glukonat dan kalsium asetat dalam larutan pembilas. Kedua zat tersebut memiliki respons yang kuat pada λ=210nm, dan tingkat pemisahan mencapai 3,0; penulis menggunakan kolom berbasis hidrogen ketika menganalisis zat yang berhubungan dengan glukosa. Beberapa zat utama yang terkait – maltosa, maltotriosa, dan fruktosa – memiliki sensitivitas tinggi di bawah detektor diferensial, dengan batas deteksi serendah 0,5 ppm dan tingkat pemisahan 2,0-2,5.
Kolom penukar anion terutama cocok untuk analisis zat anionik seperti asam organik dan ion halogen; kolom penukar kation yang kuat memiliki kapasitas dan selektivitas pertukaran ion yang lebih tinggi, dan cocok untuk pemisahan dan analisis sampel kompleks.
Hal di atas hanyalah pengenalan jenis dan rentang penerapan beberapa kolom kromatografi cair yang umum dikombinasikan dengan pengalaman penulis sendiri. Ada jenis kolom kromatografi khusus lainnya dalam penerapan sebenarnya, seperti kolom kromatografi pori besar, kolom kromatografi pori kecil, kolom kromatografi afinitas, kolom kromatografi multimode, kolom kromatografi cair kinerja ultra tinggi (UHPLC), kolom kromatografi fluida superkritis ( SFC), dll. Mereka memainkan peran penting dalam berbagai bidang. Jenis kolom kromatografi tertentu harus dipilih sesuai dengan struktur dan sifat sampel, persyaratan pemisahan dan tujuan lainnya.
Waktu posting: 14 Juni 2024