Fase gerak setara dengan fase cair darah, dan ada berbagai hal yang perlu diperhatikan saat digunakan. Diantaranya, ada beberapa “perangkap” yang harus diwaspadai.
01. Ukur pH fase gerak setelah menambahkan pelarut organik
Jika Anda mengukur pH dengan bahan tambahan organik, pH yang Anda peroleh akan berbeda dibandingkan sebelum menambahkan pelarut organik. Namun yang terpenting adalah konsisten. Jika Anda selalu mengukur pH setelah menambahkan pelarut organik, pastikan untuk menyatakan langkah-langkah Anda dalam metode yang Anda gunakan sehingga orang lain akan mengikuti metode yang sama. Cara ini memang tidak 100% akurat, namun setidaknya akan menjaga konsistensi metode. Ini mungkin lebih penting daripada mendapatkan nilai pH yang akurat.
02. Tidak ada buffer yang digunakan
Tujuan dari buffer adalah untuk mengontrol pH dan mencegahnya berubah. Banyak metode lain yang mengubah pH fase gerak, yang dapat menyebabkan pergeseran waktu retensi, bentuk puncak, dan respons puncak.
Asam format, TFA, dll. bukanlah buffer
03. Tidak menggunakan buffer dalam kisaran pH normal
Setiap buffer memiliki lebar rentang 2 unit pH, yang memberikan stabilitas pH terbaik. Buffer di luar jendela ini tidak akan memberikan ketahanan yang efektif terhadap perubahan pH. Gunakan buffer dalam rentang yang benar, atau pilih buffer yang mencakup rentang pH yang Anda perlukan.
04. Tambahkan buffer ke larutan organik
Mencampur larutan buffer dengan fase organik kemungkinan besar akan menyebabkan buffer mengendap. Dalam banyak kasus, meskipun telah terjadi curah hujan, hal ini masih sulit dideteksi. Ingatlah untuk selalu menambahkan larutan organik ke dalam fase air, yang dapat sangat mengurangi kemungkinan terjadinya buffer presipitasi.
05. Campur gradien konsentrasi dari 0% dengan pompa
Pompa yang tersedia saat ini dapat secara efektif mencampur fase gerak dan degas inline, namun tidak semua orang yang menggunakan metode Anda akan memiliki pompa berkualitas tinggi. Campurkan A dan B ke dalam satu solusi dan jalankan 100% inline.
Misalnya, 950 ml campuran awal organik dapat dibuat dengan mencampurkannya dengan 50 ml air. Keuntungannya adalah dapat mengurangi variabilitas antar HPLC dan mengurangi kemungkinan terjadinya gelembung dan presipitasi dalam sistem. Perlu dicatat bahwa rasio campuran pompa adalah 95:5, yang tidak berarti waktu retensi pra-campuran di dalam botol juga 95:5.
06. Tidak menggunakan asam (basa) termodifikasi yang benar untuk mengganti buffer
Gunakan hanya asam atau basa yang membentuk garam penyangga yang Anda gunakan. Misalnya, buffer natrium fosfat harus dibuat hanya dengan asam fosfat atau natrium hidroksida.
07. Tidak menyatakan semua informasi tentang buffer dalam metode, seperti menambahkan 5gnatrium fosfat ke 1000ml air.
Jenis buffer menentukan kisaran pH yang dapat dibuffer. Konsentrasi yang dibutuhkan menentukan kekuatan buffer. 5 gram natrium fosfat atau anhidrat dan 5 gram monosodium fosfat monohidrat memiliki kekuatan buffer yang berbeda.
08. Menambahkan pelarut organik sebelum pengecekan
Jika metode sebelumnya menggunakan larutan buffer untuk baseline B, dan metode Anda menggunakan larutan organik untuk baseline B, semoga buffer tersebut dapat mengendap di pipa pompa dan kepala pompa.
09. Angkat botol dan kosongkan tetes terakhir
Ada kemungkinan besar Anda tidak memiliki cukup fase gerak untuk menyelesaikan keseluruhan proses dan sampel Anda akan berasap. Selain kemungkinan terbakarnya sistem pompa dan kolom, fase gerak akan menguap sepenuhnya dan fase gerak di bagian atas botol akan berubah.
10. Gunakan fase gerak degassing ultrasonik
Hal yang paling penting adalah memastikan semua garam penyangga terlarut, tetapi ini adalah cara terburuk untuk menghilangkan gas dan akan dengan cepat memanaskan fase gerak, menyebabkan komponen organik menguap. Untuk menghindari masalah yang tidak perlu di kemudian hari, luangkan waktu lima menit untuk memfilter fase gerak Anda dengan vakum.
Waktu posting: 27 Agustus-2024