Wu Enhui, Qiao Liang*
Departemen Kimia, Universitas Fudan, Shanghai 200433, Cina
Mikroorganisme erat kaitannya dengan penyakit dan kesehatan manusia. Bagaimana memahami komposisi komunitas mikroba dan fungsinya merupakan isu besar yang perlu segera dikaji. Dalam beberapa tahun terakhir, metaproteomik telah menjadi sarana teknis yang penting untuk mempelajari komposisi dan fungsi mikroorganisme. Namun, karena kompleksitas dan heterogenitas sampel komunitas mikroba yang tinggi, pemrosesan sampel, perolehan data spektrometri massa, dan analisis data telah menjadi tiga tantangan utama yang saat ini dihadapi oleh metaproteomik. Dalam analisis metaproteomik, seringkali perlu untuk mengoptimalkan perlakuan awal terhadap berbagai jenis sampel dan mengadopsi skema pemisahan, pengayaan, ekstraksi, dan lisis mikroba yang berbeda. Mirip dengan proteom spesies tunggal, mode akuisisi data spektrometri massa dalam metaproteomik mencakup mode akuisisi bergantung data (DDA) dan mode akuisisi independen data (DIA). Mode akuisisi data DIA dapat sepenuhnya mengumpulkan informasi peptida sampel dan memiliki potensi pengembangan yang besar. Namun, karena kompleksitas sampel metaproteom, analisis data DIA telah menjadi masalah besar yang menghambat cakupan metaproteomik secara mendalam. Dalam hal analisis data, langkah terpenting adalah pembangunan database urutan protein. Ukuran dan kelengkapan database tidak hanya berdampak besar pada jumlah identifikasi, namun juga mempengaruhi analisis pada tingkat spesies dan fungsional. Saat ini, standar emas untuk pembangunan database metaproteome adalah database urutan protein berdasarkan metagenome. Pada saat yang sama, metode pemfilteran database publik berdasarkan pencarian berulang juga telah terbukti memiliki nilai praktis yang kuat. Dari perspektif strategi analisis data tertentu, metode analisis data DIA yang berpusat pada peptida telah menjadi arus utama yang mutlak. Dengan pengembangan pembelajaran mendalam dan kecerdasan buatan, hal ini akan sangat meningkatkan akurasi, cakupan, dan kecepatan analisis analisis data makroproteomik. Dalam hal analisis bioinformatika hilir, serangkaian alat anotasi telah dikembangkan dalam beberapa tahun terakhir, yang dapat melakukan anotasi spesies pada tingkat protein, tingkat peptida, dan tingkat gen untuk memperoleh komposisi komunitas mikroba. Dibandingkan dengan metode omics lainnya, analisis fungsional komunitas mikroba merupakan fitur unik makroproteomik. Makroproteomik telah menjadi bagian penting dari analisis multi-omik komunitas mikroba, dan masih memiliki potensi pengembangan yang besar dalam hal kedalaman cakupan, sensitivitas deteksi, dan kelengkapan analisis data.
01Contoh perlakuan awal
Saat ini, teknologi metaproteomik telah banyak digunakan dalam penelitian mikrobioma manusia, tanah, makanan, lautan, lumpur aktif dan bidang lainnya. Dibandingkan dengan analisis proteom suatu spesies, perlakuan awal sampel metaproteom dari sampel kompleks menghadapi lebih banyak tantangan. Komposisi mikroba dalam sampel sebenarnya rumit, rentang dinamis kelimpahannya besar, struktur dinding sel berbagai jenis mikroorganisme sangat berbeda, dan sampel sering kali mengandung sejumlah besar protein inang dan pengotor lainnya. Oleh karena itu, dalam analisis metaproteom, seringkali diperlukan untuk mengoptimalkan berbagai jenis sampel dan mengadopsi skema pemisahan, pengayaan, ekstraksi, dan lisis mikroba yang berbeda.
Ekstraksi metaproteom mikroba dari sampel yang berbeda memiliki persamaan dan juga beberapa perbedaan tertentu, namun saat ini terdapat kekurangan dalam proses pra-pemrosesan terpadu untuk berbagai jenis sampel metaproteom.
02Akuisisi data spektrometri massa
Dalam analisis proteom shotgun, campuran peptida setelah perlakuan awal dipisahkan terlebih dahulu dalam kolom kromatografi, dan kemudian dimasukkan ke spektrometer massa untuk perolehan data setelah ionisasi. Mirip dengan analisis proteom spesies tunggal, mode akuisisi data spektrometri massa dalam analisis makroproteom mencakup mode DDA dan mode DIA.
Dengan iterasi dan pembaruan instrumen spektrometri massa yang berkelanjutan, instrumen spektrometri massa dengan sensitivitas dan resolusi yang lebih tinggi diterapkan pada metaproteom, dan kedalaman cakupan analisis metaproteom juga terus ditingkatkan. Sejak lama, serangkaian instrumen spektrometri massa resolusi tinggi yang dipimpin oleh Orbitrap telah banyak digunakan dalam metaproteome.
Tabel 1 dari teks asli menunjukkan beberapa studi representatif tentang metaproteomik dari tahun 2011 hingga sekarang dalam hal jenis sampel, strategi analisis, instrumen spektrometri massa, metode akuisisi, perangkat lunak analisis, dan jumlah identifikasi.
03Analisis data spektrometri massa
3.1 Strategi analisis data DDA
3.1.1 Pencarian Basis Data
3.1.2de novostrategi pengurutan
3.2 Strategi analisis data DIA
04Klasifikasi spesies dan anotasi fungsional
Komposisi komunitas mikroba pada tingkat taksonomi yang berbeda merupakan salah satu bidang penelitian utama dalam penelitian mikrobioma. Dalam beberapa tahun terakhir, serangkaian alat anotasi telah dikembangkan untuk memberi anotasi pada spesies pada tingkat protein, tingkat peptida, dan tingkat gen untuk mendapatkan komposisi komunitas mikroba.
Inti dari anotasi fungsional adalah membandingkan sekuens protein target dengan database sekuens protein fungsional. Dengan menggunakan database fungsi gen seperti GO, COG, KEGG, eggNOG, dll., analisis anotasi fungsional yang berbeda dapat dilakukan pada protein yang diidentifikasi oleh makroproteom. Alat anotasi termasuk Blast2GO, DAVID, KOBAS, dll.
05Ringkasan dan Pandangan
Mikroorganisme memainkan peran penting dalam kesehatan dan penyakit manusia. Dalam beberapa tahun terakhir, metaproteomik telah menjadi sarana teknis yang penting untuk mempelajari fungsi komunitas mikroba. Proses analisis metaproteomik mirip dengan proteomik spesies tunggal, namun karena kompleksitas objek penelitian metaproteomik, strategi penelitian khusus perlu diterapkan dalam setiap langkah analisis, mulai dari perlakuan awal sampel, perolehan data, hingga analisis data. Saat ini, berkat peningkatan metode pra-perlakuan, inovasi berkelanjutan dalam teknologi spektrometri massa, dan pesatnya perkembangan bioinformatika, metaproteomik telah membuat kemajuan besar dalam kedalaman identifikasi dan cakupan aplikasi.
Dalam proses pre-treatment sampel makroproteom, sifat sampel harus diperhatikan terlebih dahulu. Cara memisahkan mikroorganisme dari sel dan protein lingkungan merupakan salah satu tantangan utama yang dihadapi makroproteom, dan keseimbangan antara efisiensi pemisahan dan hilangnya mikroba merupakan masalah mendesak yang harus dipecahkan. Kedua, ekstraksi protein mikroorganisme harus memperhitungkan perbedaan yang disebabkan oleh heterogenitas struktural bakteri yang berbeda. Sampel makroproteom dalam rentang jejak juga memerlukan metode pra-perawatan yang spesifik.
Dalam hal instrumen spektrometri massa, instrumen spektrometri massa arus utama telah mengalami transisi dari spektrometer massa berdasarkan penganalisis massa Orbitrap seperti LTQ-Orbitrap dan Q Exactive ke spektrometer massa berdasarkan mobilitas ion ditambah penganalisis massa waktu penerbangan seperti timsTOF Pro . Rangkaian instrumen timsTOF dengan informasi dimensi mobilitas ion memiliki akurasi deteksi yang tinggi, batas deteksi yang rendah, dan kemampuan pengulangan yang baik. Mereka secara bertahap menjadi instrumen penting dalam berbagai bidang penelitian yang memerlukan deteksi spektrometri massa, seperti proteom, metaproteome, dan metabolom suatu spesies. Perlu dicatat bahwa untuk waktu yang lama, rentang dinamis instrumen spektrometri massa telah membatasi kedalaman cakupan protein dalam penelitian metaproteom. Di masa depan, instrumen spektrometri massa dengan rentang dinamis yang lebih besar dapat meningkatkan sensitivitas dan akurasi identifikasi protein dalam metaproteom.
Untuk akuisisi data spektrometri massa, meskipun mode akuisisi data DIA telah banyak diadopsi pada proteom satu spesies, sebagian besar analisis makroproteom saat ini masih menggunakan mode akuisisi data DDA. Mode akuisisi data DIA dapat sepenuhnya memperoleh informasi ion fragmen sampel, dan dibandingkan dengan mode akuisisi data DDA, mode ini berpotensi memperoleh informasi peptida sepenuhnya dari sampel makroproteom. Namun karena tingginya kompleksitas data DIA, analisis data makroproteom DIA masih menghadapi kesulitan besar. Pengembangan kecerdasan buatan dan deep learning diharapkan dapat meningkatkan akurasi dan kelengkapan analisis data DIA.
Dalam analisis data metaproteomik, salah satu langkah kuncinya adalah pembangunan database urutan protein. Untuk bidang penelitian populer seperti flora usus, database mikroba usus seperti IGC dan HMP dapat digunakan, dan hasil identifikasi yang baik telah dicapai. Untuk sebagian besar analisis metaproteomik lainnya, strategi konstruksi basis data yang paling efektif adalah dengan membuat basis data sekuens protein spesifik sampel berdasarkan data sekuensing metagenomik. Untuk sampel komunitas mikroba dengan kompleksitas tinggi dan rentang dinamis yang besar, kedalaman sekuensing perlu ditingkatkan untuk meningkatkan identifikasi spesies dengan kelimpahan rendah, sehingga meningkatkan cakupan database sekuens protein. Jika pengurutan data kurang, metode pencarian berulang dapat digunakan untuk mengoptimalkan database publik. Namun, pencarian berulang dapat mempengaruhi kendali kualitas FDR, sehingga hasil pencarian perlu diperiksa dengan cermat. Selain itu, penerapan model kendali mutu FDR tradisional dalam analisis metaproteomik masih perlu ditelusuri. Dalam hal strategi pencarian, strategi perpustakaan spektral hibrid dapat meningkatkan kedalaman cakupan metaproteomik DIA. Dalam beberapa tahun terakhir, prediksi perpustakaan spektral yang dihasilkan berdasarkan pembelajaran mendalam telah menunjukkan kinerja unggul dalam proteomik DIA. Namun, database metaproteome sering kali berisi jutaan entri protein, yang menghasilkan perpustakaan spektral yang diprediksi dalam skala besar, menghabiskan banyak sumber daya komputasi, dan menghasilkan ruang pencarian yang besar. Selain itu, kesamaan antara sekuens protein dalam metaproteom sangat bervariasi, sehingga sulit untuk memastikan keakuratan model prediksi perpustakaan spektral, sehingga perpustakaan spektral yang diprediksi belum banyak digunakan dalam metaproteomik. Selain itu, strategi inferensi protein dan anotasi klasifikasi baru perlu dikembangkan untuk diterapkan pada analisis metaproteomik dari protein yang sangat mirip urutannya.
Singkatnya, sebagai teknologi penelitian mikrobioma yang sedang berkembang, teknologi metaproteomik telah mencapai hasil penelitian yang signifikan dan juga memiliki potensi pengembangan yang besar.
Waktu posting: 30 Agustus-2024